1、1、学习酶的纯化方法，酶蛋白分离提纯的原理。 2、学习掌握细胞破壁、有机溶剂分级和离子交换柱层析技术。 本实验可以为大家提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。 酵母蔗糖酶的提取及其性质研究酵母蔗糖酶的提取及其性质研究 自1860年Bertholet从啤酒酵母（Sacchacomyces Cerevisiae）中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。 蔗糖酶（invertase）（-D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。 不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。 实验原理 本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。 该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。 在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。 两种酶的蛋白l/L乙酸 3.00 5.5 0.2mol/L乙酸钠 8.80 0.2mol/L乙酸 1.20 6.0 0.2mol/L乙酸钠 9.50 0.2mol/L乙酸 0.50 6.0 0.2mol/L磷酸氢二钠 1.23 0.2mol/L磷酸二氢钠 8.77 6.5 0.2mol/L磷酸氢二钠 3.15 0.2mol/L磷酸二氢钠 6.85 7.0 0.2mol/L磷酸氢二钠 6.10 0.2mol/L磷酸二氢钠 3.90 准备二组各12支试管，第一组12支试管每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，然后加入一定量的蔗糖酶（此时的蔗糖酶只能用H2O稀释，酶的稀释倍数和加入量要选择适当。 另一组12支试管也是每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，但不再加酶而加入等量的去离子水，分别作为测定时的空白对照管。 所有的试管都用水补足到0.8ml。 3.所有的试管按一定时间间隔加入0.2ml蔗糖（0.2mol/L)开始反应，反应10min后分别加入1.0ml碱性铜试剂，在沸水浴中煮8分钟，取出速冷，分别加入1.0ml磷钼酸试剂，反应完毕后加入5.0ml水，摇匀测定。
2、酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。 尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 名称 MW 糖含量 亚基 为蔗糖的Km 为棉子糖的Km pI 最适pH 稳定pH 最适温度外酶 27万 50%双 26mM 150 mM 5.0 4.9 3.0-7.5 60 内酶13.5万 3%双 25mM 150 mM 5.0 4.5 6.0-9.0 60实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。 比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。 两种酶的性质对照表如下：一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 四、反应时间对产物形成的影响 五、pH对酶活性的影响六、底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数Km和最大反应速度Vmax的测定 本实验共有六个分实验：本实验共有六个分实验：细胞化的情况，而且可以求得酶的最适pH。 酶溶液pH值之所以会影响酶的活性，很可能是因为它改变了酶活性部位有关基团的解离状态，而酶只有处于一种特殊的解离形式时才具有活性，酶的活性部位有关基团的解离形式如果发生变化，都将使酶转入“无活性”状态。 在最适pH时，酶分子上活性基团的解离状态最适合于酶与底物的作用。 此外，缓冲系统的离子性质和离子强度也会对酶的催化反应产生影响。 按下表配制12种缓冲溶液（公用）：将两种缓冲试剂混合后总体积均为10ml。 溶液pH 缓冲试剂 体积ml 缓冲试剂 体积ml 2.5 0.2mol/L磷酸氢二钠 2.00 0.2mol/L柠檬酸 8.00 3.0 0.2mol/L磷酸氢二钠 3.65 0.2mol/L柠檬酸 6.35 3.5 0.2mol/L磷酸氢二钠 4.85 0.2mol/L柠檬酸 5.15 3.5 0.2mol/L乙酸钠 0.60 0.2mol/L乙酸 9.40 4.0 0.2mol/L乙酸钠 1.80 0.2mol/L乙酸 8.20 4.5 0.2mol/L乙酸钠 4.30 0.2mol/。
3、配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 4、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料。 5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。 6、有机溶剂沉淀法：即向水溶液中加入一定量的亲水性的有机溶剂可降低溶质的溶解度使其沉淀被析出。 （一）蔗糖酶的提取与部分纯化（一）蔗糖酶的提取与部分纯化（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。 ）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。 （2）称取）称取3g干啤酒酵母，称干啤 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3反应时间min 0 1 3 4 8 12 20 30 40 反应到时后立即向“2-12”管加入1ml碱性铜试剂中止反应碱性铜试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 沸水浴上煮8min后速冷磷钼酸试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0H2O 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 测定A650 pH对蔗糖酶活动性的影响对蔗糖酶活动性的影响 酶的生物学特性之一是它对酸碱度的敏感性，这表现在酶的活性和稳定性易受环境pH的影响。 pH对酶的活性的影响极为显著，通常各种酶只在一定的pH范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH值下所表现的活性不同，其表现活性最高时的pH值称为酶的最适pH。 各种酶在特定条件下都有它各自的最适pH。 在进行酶学研究时一般都要制作一条pH与酶活性的关系曲线，即保持其它条件恒定，在不同pH条件下测定酶促反应速度，以pH值为横座标，反应速度为纵座标作图。
4、研钵中。 二氧化硅要预先研细。 （3）量取预冷的甲苯）量取预冷的甲苯30ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊糊状状，约需，约需60分钟。 研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细分钟。 研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。 胞大部分研碎。 （4）缓慢加入预冷的）缓慢加入预冷的20ml去离子水，每次加去离子水，每次加2ml左右，边加左右，边加边研磨，至少用边研磨，至少用30分钟。 以便将蔗糖酶充分转入水相。 分钟。 以便将蔗糖酶充分转入水相。 （5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷冻离心）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机离心，机离心，4，10000rpm，10min。 如果中间白色的脂肪层厚，如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。 用滴管吸出上层有机相。 说明研磨效果良好。 用滴管吸出上层有机相。 操作步骤操作步骤（6）用滴管小心地取出脂肪程曲线，即在酶反应的最适条件下，每间隔一定的时间测定产物的生成量，然后以酶反应时间为横座标，产物生成量为纵座标，画出酶反应的时间进程曲线，由该曲线可以看出，曲线的起始部分在某一段时间范围内呈直线，其斜率代表酶反应的初速度。 随着反应时间的延长，曲线斜率不断减小，说明反应速度逐渐降低，这可能是因为底物浓度降低和产物浓度增高而使逆反应加强等原因所致，因此测定准确的酶活力，必须在进程曲线的初速度时间范围内进行，测定这一曲线和初速度的时间范围，是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基础。 反应时间对产物形成的影响 反应时间对产物浓度的影响反应时间对产物浓度的影响 管数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2.5mM蔗糖 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 乙酸缓冲液 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 H2O 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.7 1.0 0.8葡萄糖2mM 0.2碱性铜试剂 1.0 由加酶开始计时 蔗糖酶 0。
5、积，留出1.5ml测定酶活力测定酶活力及蛋白含量。 剩余部分转入清洁离心管中。 及蛋白含量。 剩余部分转入清洁离心管中。 （8）用广泛）用广泛pH试纸检查清液试纸检查清液pH，用，用1M乙酸将乙酸将pH调至调至5.0，称为称为“粗级分粗级分I”。 2.热处理热处理（1）预先将恒温水浴调到）预先将恒温水浴调到50，将盛有粗级分，将盛有粗级分I的离心管稳妥的离心管稳妥地放入水浴中，地放入水浴中，50下保温下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。 心管。 （2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4，10000rpm，离心离心10min。 （3）将上清液转入量筒，量出体积，留出）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力测定酶活力及蛋白质含量（称为及蛋白质含量（称为“热级分热级分II”）。 ）。 3.乙醇沉淀乙醇沉淀 将热级分将热级分II转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒转入小烧杯中，放入冰盐浴（ 0 加入蔗糖，立即摇匀开始计时，室温准确反应10min后，立即加碱性铜试剂中止反应。 碱性铜试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 95水浴加热8min，立即用自来水冷却 磷钼酸试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 H2O 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 A650nm 稀释后酶液的活力（按还原糖计算）：E=A650*0.2*2/A650*10*B式中：A650 第24管所测A650 A650第12管所测A650 0.2 第12管葡萄糖取样量 2 标准葡萄糖浓度2mmol/L=2mol/ml 10 反应10min B 每管加入酶液ml数 计算各级分的比活力，纯化倍数及回收率，并将数据列于下表：级分 I II III IV 记录体积(ml)蛋白质(mg/ml)总蛋白(mg)Units/ml 总Units 比活力Units/mg 纯化倍数 1 回收率%100纯化倍数纯化倍数=该步的比活力该步的比活力/第一次的比活力第一次的比活力回收率回收率=该步的总活力该步的总活力/第一次的总活力第一次的总活力 本实验是以蔗糖为底物，测定蔗糖酶与底。
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